Цель: изучить влияние химических веществ на ферментативную активность кишечной палочки, оценить эффективность биоиндикаци- онного метода оценки токсичности производственных отходов.

Материалы и оборудование: пробирки со стерильным мясо- пептонным бульоном, культура кишечной палочки, среды Гисса, 5 раз­ных веществ (отходы производств), ручка, тетрадь.

Теоретическое введение

В искусственных условиях бактерии выращивают (культивируют) на средах, удовлетворяющих потребности бактерий в питательных ве­ществах, и имеющих оптимальное значение величины рН и осмотиче­ского давления. Кроме того, питательные среды должны быть стериль­ными, а по возможности и прозрачными.

Питательные среды принято делить на несколько групп.

По происхождению среды бывают естественными и искусствен­ными. К естественным средам относят те, в состав которых входят про­дукты растительного или животного происхождения: молоко, кровь, от­вары и экстракты из овощей и фруктов, мясная вода, дрожжевые экс­тракты, яичные среды, мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар (пептоны это продукты распада белка, короткие аминокислотные це­почки, которые легко усваиваются бактериями). Искусственные среды готовят путем добавления к естественным неорганических компонентов и минеральных солей.

Среды можно по составу разделить так же на простые и сложные. К простым относятся мясо-пептонные бульон и агар. Добавление к таким средам одного или нескольких ингредиентов - крови, сахара и других составляющих делают их сложными.

По физическому состоянию питательные среды могут быть жидки­ми, полужидкими, плотными. Для сгущения к жидкой питательной сре­де добавляют вещество получаемый из водорослей - агар, который пла­вится при температуре 80-1000С и застывает при 400С. Агаризирован- ные среды разливают в пробирки в расплавленном состоянии, а затем охлаждают. Для уплотнения сред иногда используют желатину, добав­ляя ее к жидким средам в 10-20% концентрации.

По целевому назначению питательные среды могут быть: основ­ными, например, мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар, на них просто растут многие виды неприхотливых микроорганизмов; из­бирательными - предназначенными для выделения и культивирования определенного вида бактерий, например, для выделения туберкулеза из мокроты больного используют среду Левинштейна-Йенсена, содержа­щую бриллиантовую зелень, которая подавляет рост большинства мик­роорганизмов, но при этом к ней нечувствительны микобактерии ту­беркулеза; дифференциально-диагностические среды предназначенные для исследования ферментативных свойств бактерий.

В основе использования дифференциально-диагностических сред лежат различия в ферментативном составе бактерий (каждый вид бакте­рий выделяет во внешнюю среду свой набор ферментов) и способности ферментов расщеплять определенный субстрат. Например, фермент уреаза катализирует расщепление субстрата мочевины до аммиака и СО2; каталаза, катализирует расщепление пероксида водорода на воду и кислород; лактозидаза расщепляет сахар лактозу до молочной кислоты и СО2.

В данной работе используются дифференциально-диагностические среды Гисса. Среды Гисса используются для определения бактериаль­ных ферментов, расщепляющих сахара. Каждая такая среда содержит пептон, агар, какой-нибудь один сахар (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза и т.д.) и индикатор (т.е. вещество способное при закислении среды изменять цвет). В среды Гиса в качестве индикатора обычно до­бавляют водный розовый или бромтимоловый синий.

При посеве бактериальной культуры в какую-нибудь из сред Гисса, в том случае если данная бактерия выделяет фермент, расщепляющий

добавленный в среду сахар, происходит изменение окраски среды в ре­зультате накопления в ней кислоты. При посеве бактерий на несколько различных сред Гисса можно установить, какие именно ферменты дан­ный вид бактерий вырабатывает, а какие нет. И, в конечном счете, со­ставить ферментативный «портрет» исследуемой бактериальной куль­туры.

Практическая часть

В качестве тестовой бактериальной культуры используем кишеч­ную палочку (Е. соН). Объектом изучения могут быть отходы угле- и горнодобывающего производства, металлургические шлаки, нефтяные шламы, образцы загрязненных почв, золошлаковые отходы котельных и т. д.

Ход работы:

1.В пробирки со стерильным мясо-пептонным бульоном вносится по 0,5 г разных исследуемых веществ.

2.В каждую пробирку стерильной бактериальной петлей засевают чистую культуру кишечной палочки.

3.Ставят контрольную пробу, делая посев бактерий в пробирку с мясо-пептонным бульоном.

4.Все пробирки подписывают и оставляют на несколько дней при комнатной температуре.

5.Пробирки просматривают, отмечают рост бактерий в бульоне (помутнение, осадок, пленка на поверхности). Из каждой пробирки, включая контрольную, делают пересев бактерий на среды Гисса.

6.Все пробирки со средами Гисса подписывают и оставляют на несколько дней при комнатной температуре.

7.Пробирки просматривают, отмечают в какой из них изменился цвет среды и заполняют таблицу 3-1 (проставляя в соответствующей ячейке «+» если в пробирке произошло расщепление субстрата и «-» если цвет среды не изменился).

По результатам работы делают заключение, сравнивая контроль­ные и опытные данные.